作者：裴旭东，叶启发，肖建生，明英姿，牛 冰

    【摘要】  目的  探讨缺血预处理(IP)对大鼠肝移植缺血再灌注（IR）损伤后肝CyclinD1和CyclinE表达的影响，以了解移植肝再生能力和功能不良的影响因素。方法  将SD大鼠90只随机分为缺血预处理组（IP组）、对照组（OLT组）和假手术组（SO组）3组；用全自动生化分析仪来检测肝功能；通过免疫组化S-P法来测定移植肝CyclinD1和CyclinE的变化。结果  对照组中大鼠移植肝缺血再灌注损伤后血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)明显升高，CyclinD1和CyclinE的百分含量较低，提示移植肝细胞再生不良；实验组经缺血预处理后血清中ALT、AST稍升高，幅度<对照组，CyclinD1和CyclinE的百分含量很高，提示移植肝细胞再生活跃。结论  缺血预处理能够启动内源性保护移植肝的相应机制，可促进肝CyclinD1和CyclinE的合成，激发肝细胞的增殖和再生。
   
    【关键词】  大鼠肝移植；缺血再灌注；缺血预处理；CyclinD1；CyclinE
        
    【Abstract】  Objective  To approach expressed influence of CyclinD1 and CyclinE in period of ischemia-reperfusion(IR) post injury of liver transplant by ischemia-pretreatment (IP) in rat， with a view to comprehend influence factor of transplanted liver regeneration capacity and dysfunction.Methods  Ninety SD rats were randomly divided into three groups：ischemia-pretconditioning group (IP group)，control group (OLT group) and sham operation group (SO group)；to detect hepatic function by automatic biochemistry analyzer；to determine changes of CyclinD1and CyclinE of transplanted hepatic cell by immunity histochemistryS-P method.Results  Serum ALT，AST obviously stepped up of control group rat of transplanted liver ischemia-reperfusion postinjury， percent content lied low comparatively；to hint dysregerated of transplanted hepatic cell.Serum ALT， AST sightly heighten， and content little to control group，in experiment group rat of being ischemia-pretconditioned， percent content express quite hight，to hint transplanted hepatic cyothesis active.Conclusion  Ischemia- pretconditioned can switch on corresponding mechanisms of endogenous conserve transplanted liver，be able to promote synthesis of CyclinD1and CyclinE，to stimulate hepatocelluar multiplication and regeneration.
   
    【Key words】  rat transplanted；ischemia-reperfusion；ischemia-pretconditioning；CylinD1；CyclinE
   
    缺血再灌注(IR)损伤普遍贯穿于肝移植始终，它是临床上肝移植术后原发性移植物无功能的首要因素。Sasaki等证实IR损伤可使鼠移植肝细胞凋觯?］，近年来的研究也表明肝脏再生能力的大小也是IR损伤后移植肝功能恢复的关键环节。缺血预处理（IP）是公认的对肝脏IR损伤有保护作用［2］。为研究移植肝IR损伤程度与肝细胞再生能力的关系，本实验以移植肝IR损伤后CyclinD1和CyclinE的表达作为细胞增殖指标，以检测IP对IR损伤后移植肝细胞增殖的影响，从而进一步探讨肝移植术后肝功能不良的原因。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  实验动物与分组  纯系Wistar雄性大鼠90只，体重280～320mg，由湖南农业大学实验动物研究中心提供。普通喂养，自由进食，术前12h禁食，将大鼠随机分为3组：（1）取样缺血预处理组(IP组)：即在供肝冷转灌注前缺血处理10min，10min再灌注，循环2次，然后行双袖套法原位肝移植术。术后2h、6h、24h各时间点取肝脏标本和经下腔静脉采血4ml待测。各时间点分别取样6只。（2）对照组 (OLT组)：即单纯行双袖套法原位肝移植术，术后2h、6h、24h各时间点取肝脏标本和经下腔静脉采血4ml待测。各时间点分别取样6只。（3）假手术组（SO组）：即血流阻断与复流及原位肝移植外，其余处理同上。分别取样6只。
   
    1.2  实验器械与试剂  肝功能检测用全自动生化分析仪（AU800  Olympus）。免疫组化试剂CyclinD1单克隆抗体(兔抗大鼠），购于北京中杉金桥生物技术有限公司；CyclinE单克隆抗体（兔抗大鼠），购于上海长岛生物技术有限公司；DAB显色试剂购于福州迈新生物技术有限公司。
   
    1.3  方法
   
    1.3.1  原位肝移植模型的建立  按照Kamada［3］和孙君泓［4］报道的术式建立大鼠原位肝移植模型：即不重建肝动脉的双袖套法大鼠肝移植术。
   
    1.3.2  标本的制备和测定方法  取移植肝组织用4%的复合甲醛固定待制石蜡标本，行光镜学检查及行免疫组化S-P法检查，同时将所采静脉血2ml，11000r/min离心5min取血清置于-70℃深低温水箱保存检测转氨酶。
   
    1.4  结果判断标准  由两位病理医生在光镜200倍视野下，每张切片取5个视野，用HPIAS—1000型彩色图像分析仪系统测定CyclinD1和CyclinE表达情况，结果用阳性细胞率来表示：阳性细胞率（%）=视野中阳性细胞数/视野中总细胞数× 100%。
   
    1.5  统计学方法  所有数据以均数±标准差（x±s）来表示，以SAS统计软件包分析处理，多个样本均数间比较用重复测量设计方法分析和单因素方差分析，IP组与OLT组比较用t检验。
   
    2  结果
   
    2.1  一般情况  该部分供肝手术时间、血管袖准备时间和受体手术时间分别为（30±3.30）min、(11±3.83)min和（31.5±3.20）min。其中无肝期为18～22min，平均（19.67±1.63）min，手术成功率94.1%。未处死的大鼠1周存活率达88%，最长存活72天。
   
    2.2  各组血清ALT、AST含量  见表1。OLT组各时间点ALT、AST较SO组显著升高，且随再灌注时间延长而逐步升高，以移植肝再灌注2h升高最为明显，以后升高幅度降低。IP组各时间点ALT、AST升高幅度远低于OLT组，与之相比较，P<0.01。
   
    2.3  移植肝细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE标记阳性细胞率  SO组CyclinD1、CyclinE均未发现阳性表达。IP组各时间点CyclinD1、CyclinE阳性细胞率均高于OLT组，尤以6～24h升高明显；而IR组6h细胞凋亡显著升高，增殖低下，24h仍维持很低水平。24h CyclinD1与CyclinE阳性细胞率分别为0.47±0.23、0.44±0.21与OLT组0.21±011、0.20±0.08比较，差异具有非常显著性（t=7.57，P<0.01），见表2。笔者还发现CyclinD1表达时限等同于CyclinE的表达，阳性细胞表达率高于CyclinE的表达率。

表1  移植肝IR损伤后血清ALT、AST含量变化  （x±s，u/L）

注：同时间点IP组与OLT组相比较，P<0.01

表2  移植肝IR后细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE阳性细胞率表达  （x±s）

注：IP组与OLT组相比较，△P<0.05；IP组与OLT组相比较，*P<0.01

    2.4  光镜下肝脏病理组织学变化与SO组肝脏组织相比较  OLT组（见图1、图2）中肝脏细胞广泛水肿，以中央静脉周围为主，肝组织结构混乱可见小滴样脂肪变性，肝窦内大量中性粒细胞浸润；灌注后24h可见部分肝窦狭窄，并有红细胞残片，界板破坏。而IP组（见图3、图4）仅有轻度肝细胞水肿，肝窦内有少许中性粒细胞散在，小叶结构基本完整。

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